ELISA实验操作指南

发布时间：2023-05-24 热度：256

一、ELISA的样本收集与处理

1.血清

血清是*常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。

操作过程：用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出（*好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出）。4℃ 1000×g离心20分钟，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

注意事项：采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化物酶活性物质，在以HRP为检测酶类的ELISA检测中会出现非特异显色，导致检测结果不准确。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性HRP，从而导致检测假阳性出现。

2.血浆

用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30 min内4℃ 1000×g离心15 min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。

常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠或枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。

3.细胞培养上清

取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

4.细胞裂解液

1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹打下来。悬浮细胞可省略此步骤。

2）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS洗3次。

3）加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板的一个孔的细胞量需要添加150~250 μL PBS或细胞裂解液重悬。

4）将样品放入-20℃或-80℃环境，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解目的。

5）4℃ 10000×g离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

5.组织匀浆液

1）将组织样本用PBS（0.01M，PH7.4）冲洗，洗去组织表面残留的血渍或杂质。

2）将组织块称重，记录后剪碎，应尽量将组织块剪小，使匀浆更充分。

3）将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按组织重量∶PBS体积=1∶9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）。

4）吸取匀浆液到离心管，4℃ 5000×g离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

6.尿液、唾液等其他液体生物样本

1000×g离心20min，取上清即可检测。

注意事项：因为ELISA只能检测可溶性蛋白含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。

二、试剂盒与样本保存

1.样本保存

①　样本收集后如在一周内检测，可置于4 ℃保存；

②　若不能及时检测，请按一次使用量进行小份分装，置于-20 ℃（1个月内检测）或-80 ℃（半年内检测）保存，避免反复冻融。

③　还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性结果出现。

2.试剂盒保存

ELISA试剂盒有效期为6个月，储存温度：2-8℃。

一周内使用可将试剂盒整体存储于4℃，若需长时间存放或多次使用，请收到试剂盒后及时拆开外包装，并根据试剂盒内说明书要求（酶标板、标准品冻干粉、浓缩生物素化抗体或浓缩酶结合物等应放置在-20°C保存，其它组分放后于4℃存放）分别保存各组分。建议将拆分保存的各组分用自封袋装好，并按货号做好标记。

三、ELISA试剂盒常见问题

1.科研和临床产品的区别?

①　临床试剂是经过权威机构，如FDA，CFDA等认可的可用于临床诊断或实验的试剂，而科研试剂一般是厂家自行研制，且只能用于科学研究的试剂，不需要通过权威机构认证。

②　用于临床诊断的试剂盒是需要注册医疗器械使用许可证的，科研试剂不需要。

③　临床产品一般仅检测血清血浆等单一样本类型，科研试剂比临床试剂种类多、范围广，但一般来说临床产品的质量，其稳定性和可重复性等性能会优于科研试剂。

2.试剂盒能检测什么物种?

目前我们的试剂盒检测的种属主要包括人、小鼠和大鼠，小部分指标涉及猴、免、猪和鸡等特殊种属。对于那些命名中带有特定物种名称的试剂盒（如人）是专门针对此物种的。如果说明书中没有指明物种，该试剂盒即在常规哺乳动物种属内是通用的。如果检测物种特殊，建议先跟技术支持确认样本适用性。

3.ELISA试剂盒96孔板，第一次使用后可以隔3个月后再用吗?

我们试剂盒有效期为半年，您将试剂盒拆封后，按照说明书上的存放温度分组分保存即可。试剂盒在存储得当的情况下，3个月后使用问题不大，但需要注意4℃放置试剂不要贴冰箱内壁存放，可能会因为冰箱出现霜冻而影响其活性。您如果要进行多次实验，需要将不用的板条提前拆卸，并放置于铝箔袋中，按照说明书要求的温度密封保存。

4.试剂盒的检测范围和灵敏度分别代表了什么意思?

①　灵敏度是试剂盒多次检测空白样本计算得到的*低检出浓度，只有样本浓度高于试剂盒的灵敏度时，其检测结果才有意义。

②　试剂盒检测范围是表示当样本浓度落在该范围内，其浓度和检测OD值有良好的线性关系，能够准确定量样本的浓度情况。

四、标曲拟合

1.ELISA数据如何处理?

①　ELISA实验中标准品&样品均建议做复孔（二复孔或三复孔），并计算每个浓度标准品的平均OD值;

②　对于夹心法的ELISA试剂盒，需要用各组的平均OD值减去空白孔的OD值，得到校正值。如果是竞争法的ELISA试剂盒，则不需要进行此步骤。

③　然后，以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用作图软件在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数拟合标准曲线。

④　将样本的OD值代入到标曲中，就能得到相应的浓度。如果样本进行过稀释，还需要乘以对应的稀释倍数。

2.标准曲线使用的是什么拟合函数?可以用Excel来制作标曲吗?为什么我做出的标曲不是一条直线?

①　推荐使用Origin软件，或其他含有4-PL（4参数logistic）函数模型的软件去拟合得到标准曲线，4-PL的拟合方式能够更精确的反映浓度和吸光度的线性关系，从而更准确地获得样品中待测物质的浓度值。

②　Excel拟合方式一般为直线和多项式，这两种拟合方程均不推荐作为ELISA标准曲线拟合方式。

3.做标准曲线有哪些地方需要注意?

①　检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性；

②　建议做二复孔或三复孔，并计算每个浓度标准品的平均OD值；

③　标准曲线的样品数一般为8个点（包括空白孔），*少要保证有6个点。竞争法拟合标曲时不需要减去空白孔。