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如何玩转WB实验

免疫印迹免疫印迹(Western blot, WB)是蛋白组学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的*常用方法之一。WB先要进行 SDS-PAGE,然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上,而后利用抗原 - 抗体 - 标记物显色来检测样品,可以用于定性和半定量。免疫印迹(WB)实验流程一、蛋白提取➊ 细胞样品在提取前需要使用PB..

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如何玩转WB实验

发布时间:2023-03-17 热度:379

免疫印迹

免疫印迹(Western blot, WB)是蛋白组学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的*常用方法之一。WB先要进行 SDS-PAGE,然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上,而后利用抗原 - 抗体 - 标记物显色来检测样品,可以用于定性和半定量。

免疫印迹(WB)实验流程

一、蛋白提取

➊ 细胞样品在提取前需要使用PBS清洗两遍,以减少培养基对样品的干扰,悬浮细胞可500Xg低速离心后收集进行蛋白提取。贴壁细胞可在培养器皿中直接进行蛋白提取。蛋白提取前建议进行细胞计数,以确定提取中添加裂解液的比例,得到*佳提取效率。

❷ 组织样品在提取前也需要用PBS清洗,一些含血量丰富的组织,建议使用红细胞裂解液去除红细胞,以避免血液中IgG对后续实验的影响。

❸ 为了防止蛋白降解、去磷酸化,各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。

❹ 在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果,有条件的话,可以对抽提悬液进行超声破碎处理;超声的时候,因为超声发热损伤蛋白,需要把要超声的样本放到冰水混合物里。

❺ 此外如果没有裂解buffer,可以用1×SDS loading buffer代替来抽提蛋白,其效果类似于SDS裂解液,不过抽提后的样本不能进行浓度测定。

❻ 蛋白煮沸变性一般是95-100°C,5-10min,水浴锅煮沸时,可用带夹EP管防止EP管盖弹开,使水浴锅内的水进入而使样品废掉。

二、蛋白电泳

正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域*大限度的分离开,从而使条带的位置,杂带位置等一些因素的影响降到*低;目的蛋白分子量与胶浓度的选择见下表:

1.png

采用SDS-PAGE电泳,每孔上样等体积总蛋白,上样时,先加marker,如有空置的加样孔,须加等体积的1×loading buffer,以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为80V,使样品跑得慢一些,充分浓缩,到达分离胶后调为120V,电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳。关于电泳液,建议新鲜配制,也可先配10x的,然后现用现稀释。

Tips:蛋白电泳

➊ 玻璃板清洗后,为了使表面的水快速晾干,可以在烘箱中放置几分钟,拿出来的时候后需平衡至室温再灌胶,不然很容易产生气泡;

❷ 配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存,当我们按比例配好混合液的时候,要等混合液恢复室温时,再灌胶,不然也很容易产生气泡;

❸ 玻加水液封时,速度要慢,可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动,不然很容易将分离胶冲变形;

❹ 梳子注意和玻璃板匹配,1.5mm的梳子很难插进1mm的玻璃板中,暴力插入会破坏胶板;如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中,由于中间有空隙,就会有胶凝固在里面;

❺ 浓缩胶凝好可以泡到电泳缓冲液里,比较容易拔出。



三、蛋白转膜

膜的选择

➊ 现在用的*多的是PVDF膜,用之前需注意:①先在纯甲醇中浸湿膜15s,保证PVDF膜充分活化;②将膜放入转膜缓冲液中平衡至少5min;

❷ NC膜不需要甲醇活化。

膜的孔径

➊ 根据被转移的蛋白分子量大小,选择不同孔径的印迹膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固;

❷ 通常用0.45μm和0.2μm两种规格的印迹膜。大于20KD的蛋白可用0.45μm 的膜,小于20KD的蛋白就要用0.2μm的膜。

小分子蛋白

➊ 小分子蛋白很容易转过,所以摸索适合自己蛋白的转膜条件很重要,这一步很难说一次就成功,所以刚开始的时候可以在接触胶面的PVDF膜上再放一张PVDF膜,转膜结束后,丽春红染色,观察使用的条件是否会转过头;

❷ 小分子蛋白转膜液中一定不要加SDS,因为SDS会影响转膜效果;

❸ 小分子蛋白湿转参考100V恒压,或者150-200恒流,40-60min,都可以跑出来结果,同时也可以保证内参的效果很好;

❹ 小分子蛋白转膜液甲醇浓度为20%;

❺ 分子量小于10 kDa的多肽或蛋白,建议使用Tricine-SDS-PAGE电泳和转膜系统。


大分子蛋白

➊ 转膜时间要适当延长,220V,300mA,湿转,建议时间在2h30min-3h,因为转膜时间很长,可以预冷转膜缓冲液,同时提前准备好足够的冰袋降温;

❷ 转膜液中可以加入适量SDS(浓度0.1%),对于大分子量蛋白加入SDS是为了增加了蛋白表面电荷,从而增加转膜效率;

❸ 大分子蛋白转膜液甲醇浓度为5%。

四、印迹膜封闭

➊ 脱脂奶粉是*常用的经济配方。

❷ 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素;建议使用BSA。

❸ 分析磷酸化蛋白须用BSA。脱脂奶粉含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化;也不适用于碱性磷酸酶(AP)检测系统。

❹ 如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统,封闭液不应加叠氮钠(NaN3),因为叠氮钠对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用。

❺ 如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统,可使用酪蛋白封闭,同时须选择TBS缓冲溶液,不可使用PBS缓冲溶液,因为PBS缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。

五、一抗二抗孵育

➊ 建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书,了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。

❷ 选择二抗抗体取决于一抗抗体的动物来源。例如,如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体,二抗抗体必须是抗小鼠的抗体;如果一抗抗体是兔来源多克隆抗体,二抗抗体必须是抗兔的抗体。

❸ 建议使用商品化的抗体稀释液稀释一抗二抗,不仅能有效减少一抗或二抗的非特异性结合,并有效提升稀释后抗体的稳定保存时间,可重复利用。

六、显影成像

➊ 建议使用高信号强度、高灵敏度、高稳定性的ECL化学发光试剂。

❷ 显影液务必覆盖整个印迹膜。

❸ 显影液A液和B液吸取过程中必须更换移液器枪头,避免相互污染失效。

❹ ECL工作液需避免强氧化剂如次氯酸钠等对工作液的影响。

❺ 须确保试剂瓶干净,无微生物或其它试剂污染。为了小伙伴们的安全,请穿实验服并佩戴一次性手套。

七、免疫印迹(WB)常见问题

01 高背景

2.png

02 信号弱或无信号

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03 非特异性条带

4.png

04 弥散型条带

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图片1.png


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